Оценка натуральной супрессорной активности больных с сахарным диабетом пожилого возраста



Дата31.07.2020
өлшемі86 Kb.
ОЦЕНКА НАТУРАЛЬНОЙ СУПРЕССОРНОЙ АКТИВНОСТИ БОЛЬНЫХ С САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ ПОЖИЛОГО ВОЗРАСТА
А.Т. Маншарипова, Ж. Абылайулы, Г.К. Молдабек, З.Г. Ким, Н.Н. Беляев, Ю.В. Перфильева, Т.А. Супниязова
Казахский Национальный Медицинский Университет им. С.Д. Асфендиярова Институт молекулярной биологии и биохимии им. М.А. Айтхожина МОН РК
г. Алматы, Казахстан
В настоящее время принято считать, что аутоиммунный процесс возникает из-за патологических реакций Т-клеток и антител, производимых В-клетками, с собственными эпитопами. В норме же в здоровом организме поддерживается состояние иммунной толерантности к собственным антигенам. Очевидно, что вопрос о срыве аутотолерантности является узловым для понимания механизмов развития аутоиммунных заболеваний. Между тем, по современным представлениям существует ряд гипотетических механизмов центральной и периферической аутотолерантности и ее срыва, что предполагает многопричинность развития аутоиммунных заболеваний, в том числе и эндокринных. Однако тот факт, что у всех людей в сыворотке крови в малых количествах в норме присутствуют антитела, реагирующие с ДНК, компонентами цитоскелета, миелином, сывороточным альбумином, тиреоглобулином, цитохромом С, коллагеном, трансферином и другими клеточными белками свидетельствует о том, что само по себе наличие аутоиммунного состояния еще не определяет развитие аутоиммунного заболевания. Показано, что разрушение у мышей некоторых генов, например, гена трансформирующего фактора роста  (TGF) с неизбежностью приводит к развитию аутоиммунопатологии. Следовательно, в развитии аутоиммунных процессов важную роль должны играть нарушения регуляции иммунной системы.

На сегодняшний день в спектр регуляторных клеток, оказывающих иммуносупрессорное действие, включены CD4+ Т-хелперы 2-го типа (Th2), Т-хелперы 3-го типа, CD8+ цитотоксические Т-лимфоциты, NKT-клетки, NK-клетки, а также макрофаги [1]. Причем иммуносупрессорные эффекты системного порядка оказывают продуцируемые этими клетками цитокины TGF, IL-10, IL-13, а также PGE2 и NO. Абсолютным лидером среди иммуносупрессорных цитокинов является TGF, секретируемый практически всеми типами регуляторных клеток.

Ключевая же роль в аутоиммунном процессе, как считают, принадлежит так называемым Т-регуляторным клеткам, или Трегам, несущим специфические маркеры CD4+CD25+ [2]. Их удаление приводит к развитию различных аутоиммунных заболеваний у генетически предрасположенных линий мышей и, наоборот, перенос этих клеток мышам, с дефицитом этой клеточной субпопуляции, прекращает развитие аутоиммунного процесса.

Нас заинтересовали так называемые натуральные супрессорные (NS) клетки, в настоящее время относимые к популяции ранних гемопоэтических предшественников и стволовых клеток по наличию маркера CD34 [3]. Свое название эти клетки получили благодаря способности угнетать различные иммунологические реакции в условиях in vitro без участия антигенов главного комплекса гистосовместимости.

NS-клетки обнаруживаются у мышей в нормальном костном мозге, а также в селезенке после тотальной иррадиации, обработки циклофосфамидом и возникновении опухоли. Характерной особенностью NS-клеток является отсутствие у них маркеров Т- и В- лимфоцитов и макрофагов. Доказано, что основным супрессорным фактором NS-клеток является трансформирующий фактор роста-β (TGF-β).

Лаборатория молекулярной иммунологии и иммунобиотехнологии Института молекулярной биологии и биохимии им.М.А.Айтхожина, занимающаяся изучением NS-клеток, разработала метод выделения и оценки активности NS-клеток из костного мозга мышей и крыс [4]. Этот метод также оказался пригодным для селезенки животных и периферической крови человека. Сущность метода заключается в двухстадийном разделении исходной взвеси мононуклеарных клеток на градиентах плотности перкола, в результате которого получают три изопикнические фракции, содержащие три различных субпопуляции NS-клеток: NS1, NS2 и NS3. Все три фракции отличаются друг от друга рядом свойств. Во-первых, они имеют различные плавучие плотности: 1,080, 1,090 и >1.090, но <1,100 г/мл соответственно. Во-вторых, они обладают различной чувствительностью к специфическим индукторам NS-клеток. Так, NS1 стимулируются только IL-2 и гистамином, NS2 отвечают только на IL-3, NS3 чувствительны только к IL-2 и не реагируют на гистамин. Метод проточной цитофлуориметрии, основанный на дискриминации клеток, идентифицированных с помощью специфических моноклональных антител, позволил подтвердить, что клетки всех трех субфракций натуральных супрессоров не содержат маркеров зрелых Т-, В-клеток и макрофагов, в то время как большинство клеток (73,5±2,8%) содержат общий маркер гемопоэтических стволовых клеток/предшественников - CD34 [5].

В ходе дальнейших исследований было установлено, что ГСК и ранние предшественники костного мозга обладают индуцибельной натуральной иммуносупрессорной активностью, включающей торможение пролиферации лимфоидных клеток, торможение цитолитической активности NK-клеток и CTL, а также переключение в T-хелперных клетках продукции цитокинов с Th1-типа на Th2-тип. Иммуносупрессорная активность ГСК, индуцированная IL-2 и гистамином (NS1), IL-3 (NS2) или IL-2 (NS3), осуществлялась через продукцию супрессорных цитокинов (TGF-β, IL-6 и IL-13) и оксида азота [6].

Таким образом, изучаемые ГСК/предшественники являются типичными иммунорегуляторными клетками и потому могут претендовать на роль системы, контролирующей аутотолерантность. Следовательно, срыв аутотолерантности должен зависеть от активности циркулирующего в крови пула ГСК.

Логично предположить, что при аутоиммунных заболеваниях имеет место недостаточность циркуляции ГСК в периферическом кровотоке или существует нарушение функциональной активности циркулирующих ГСК, в частности, иммуносупрессорной активности. Возможно, различные фракции пула ГСК играют различную роль в развитии аутотолерантности и срыв ее связан с дефектом какой-то одной субпопуляции.

Целью настоящего исследования явилась оценка натуральной супрессорной активности у больных с эндокринной патологией.

Материалы и методы.

В работе использована гепаринизированная периферическая кровь 7 здоровых доноров и 21 больных с сахарным диабетом 2 типа в возрасте от 60 лет и старше.

Жидкую культуральную среду RPMI-1640, используемую для отмывок, готовили из сухого препарата, растворяя его в деионизированной воде, согласно прописи фирмы-производителя, стерилизуя конечный продукт путем ультрафильрации через мембранный фильтр с диаметром пор 0,22 мкм.

Для культивирования стволовых клеток использовали среду Stemline II, разработанную специально для культвирования ГСК фирмой Sigma. Полная культуральная среда включала 10% фетальной телячьей сыворотки, 4 мМ L-глутамина, 100 МЕ/мл пенициллина и 100 мкг/ мл стрептомицина.

Двухступенчатый градиент плотности перкола готовили, используя методические подходы, описанные в работе [4]. В коническую стеклянную пробирку осторожно последовательно наслаивали по 1 мл перкола различной плотности: 1,100 и 1,090 г/мл. Соответствующие плотности перкола получали по прописи, рекомендованной фирмой-производителем.

Периферическую гепаринизированную кровь наслаивали на двухступенчатый градиент плотности перкола и центрифугировали при 1400g 20 мин и 5оС. Фракцию с плавучей плотностью 1,090 г/мл собирали и отмывали от примеси перкола средой RPMI, центрифугируя при 150g 8 мин, и ресуспендировали в специальной среде Stemline II, содержащей 10 % фетальной телячьей сыворотки, доводя до концентрации 2х106 кл/мл. Количество живых клеток в пробе подсчитывали с помощью гемоцитометра Горяева, используя краситель трипановый синий для исключения мертвых клеток.

Полученную взвесь клеток разливали по коническим контейнерам и инкубировали 1 ч при 37оС с IL-2 (фармакологический препарат Ронколейкин) в концентрации 50 МЕ/мл или без него в концентрации 2х106 кл/мл.

После окончания инкубации клетки осаждали центрифугированием при 150g 10 мин, добавляли к ним по 2 мл полной культуральной среды Stemline II, вносили в 96-луночные культуральные планшеты по 200 мкл и культивировали при стандартных культуральных условиях (37оС, 5% СО2 и 90% влажности) 48 ч. По окончании инкубации планшеты центрифугировали для осаждения клеток (10 мин при 400g). Бесклеточные супернатанты собирали, замораживали и хранили при -70оС до определения в них цитокина TGF.

Содержание TGF определяли с помощью иммуноферментного анализа (ИФА), используя коммерческий набор согласно инструкции фирмы-производителя.

Математическая обработка результатов.

Для статистической обработки использовали прикладную программу Microsoft Excel. Вычисляли среднюю арифметическую, среднюю квадратическую ошибку средней арифметической и достоверность различия средних Р по критерию Стъюдента (ТТЕСТ).

Результаты и обсуждение.

Оценка продукции TGF исследуемой фракцией ГСК у здоровых доноров показала, что культивируемые клетки секретируют в среду в среднем 870±51 пг/мл этого цитокина (рис.1). Одночасовое воздействие IL-2 приводило к значительному повышению продукции TGF (1453±52 пг/мл). Данный факт может свидетельствовать о реакции NS1- субпопуляции NS-клеток, поскольку именно эта субпопуляция реагирует на IL-2.



Во всех исследуемых группах больных отмечалась спонтанная продукция TGF, уровень которой значимо не отличался от уровня здоровых доноров (АИТ – 678±82 пг/мл, ДТЗ – 696±41 пг/мл, СД – 543±31 пг/мл). Однако клетки больных с сахарным диабетом не способны были реагировать на воздействие IL-2 усилением продукции TGF (744±62, 754±48, 407±28 пг/мл соответственно).

Рисунок 1 – Продукция TGF фракцией мононуклеарных клеток периферической крови, обогащенной ГСК/предшественниками, у здоровых доноров и больных с сахарным диабетом.

Обозначения: н/с – нестимулированные клетки, IL-2 – клетки, стимулированные интерлейкином-2.

Неспособность ГСК/предшественников активироваться IL-2 возможно приводит у больных с эндокринными заболеваниями к выпадению этих клеток из регуляторного цикла, направленного на ограничение аутоагрессивной активности собственных Т-клеток.

Таким образом, у больных с сахарным диабетом 2типа пожилого возраста наблюдалась функциональная недостаточность активности циркулирующих ГСК/предшественников.


Литература

  1. Беляев Н.Н., Zakiryanova G.K., Belyaev N.N. Regulatory T cells and autoimmune diseases // Биотехнология. Теория и практика.-2007.-№ 2 .- с. 34.

  2. Беляев Н.Н. Натуральная супрессия как иммунологическая функция гемопоэтических стволовых клеток//Научные приоритеты казахстанской аллергологии и иммунологии. Алматы, Раритет.- 2005.- с.74-88.

  3. Закирьянова Г.К., Беляев Н.Н. Изопикническое разделение клеток костного мозга //Методы молекулярной биологии, биохимии, иммунохимии и биотехнологии, Алматы.-1999.-с.142-145.

  4. Богданов А.Ю. Молекулярные механизмы активации естественных супрессорных клеток альфа-фетопротеином. Автореф. дисс. канд. биол. наук, Алматы.- 2005.- 22 с.

  5. Богданов А.Ю., Беляев Н.Н. Альфа-фетопротеин как индуктор натуральных супрессорных (NS) клеток костного мозга. II. Молекулярная природа супрессорных факторов // Биотехнология. Теория и практика.-2004.-№3.-с.90-98.


Қант диабетімен және метаболиқ синдром ауыратын науқастардың табиғи супрессорлы белсенділігін оқып үйрену

Маншарипова А.Т., Абылайулы Ж., Молдабек Г.К., Бердышев Г.А., Абдраимова Б.З., Беляев Н.Н., Перфильева Ю.В., Супниязова Т.А.

Кардиология және ішкі аурулар ғылыми-зерттеу институты

М.А. Айтхожин атындағы молекулярлы биология мен биохимия институты (МБмБИ)


Қант диабетімен ауыратын науқаста осы патология жағдайында ағзаның жоғары аутоиммунизация мүмкіндігін дәлелдейтін гемопоэтикалық клеткалардың белсенді айналымының функционалды жеткіліксіздігі байқалды.

The natural suppressor activity in patients with diabetes mellitus and metabolic syndrome
Mansharipova A. T., Abulaiuly Zh., Moldabek G.K., Berdishev G.A., Abdraimova B. Z., Belaev N. N., Perfilyeva Y. V., Supniazova T.A.

Scientific research institute of cardiology and internal diseases. Almaty.



M.A Aitkhozhin Institute of molecular biology and biochemistry. Almaty.
Functional insufficiency of the activity of circulating haematopoetic stem cells were studied in patients with diabetes mellitus and metabolic syndrome that shows a possible increase in the autoimmunization of the organism in these pathologies.
Каталог: rus -> wp-content -> uploads -> 2011
2011 -> Электив курс бойынша «аив-инфекциясының эпидемиологиясы, емдеуі және алдын алу» мпф қоғамдық денсаулық сақтау мамандығының 5 Курс студенттеріне 2011-2012 оқу жылына емтихан тест сұрақтары
2011 -> Хром қосындыларының Әсері кезіндегі шажырқай лимфа түйіндерінің ЖҰмсақ бауының микроанатомиялық ҚҰрылымы
2011 -> Хайрулдаева Айсулу Маткасымовна
2011 -> 1. Жұтқыншақ арты кеңістіктің жалғасы не? көкіректің алдыңғы жағы
2011 -> Морфогенез ткани гипофиза после аллотрансплантации
2011 -> 1 Несеп шығару өзегі (урахуса) бітіспегендегі рентгенологиялық диагностикалау әдісі. А) цистография + фистулография
2011 -> 1. Эпидемиология жалпы медициналық ғылым ретiнде оқытады тұрғындардың жаппай сырқаттылығының таралу себептерiн
2011 -> Рыскиева Айымжан Әбуқызы
2011 -> Көз алмасының қандай құрылымдары көзішілік сұйықтықты бөліп шығарады?


Достарыңызбен бөлісу:


©netrefs.ru 2019
әкімшілігінің қараңыз

    Басты бет